纳米颗粒已被越来越多地用于靶向药物递送和受控药物释放的研究。目前的研究趋势是使用金属和磁性纳米颗粒，这些金属纳米粒子最初被用作成像中的造影剂，但是最近的进展表明，它们在药物和基因递送以及治疗中具有重要的意义。当前的纳米颗粒分布测量方法通常涉及将荧光颗粒附着到纳米颗粒上。这取决于纳米粒子的浓度，目标区域的大小和荧光强度，可以在活体的情况下使用光学成像分析半透明的小鼠，以确定粒子是否在正确的区域内。剖检荧光也可以用于确定小鼠不同器官中的纳米颗粒水平。但是，这些方法难以对纳米粒子进行高分辨率的观察，并且不能确定荧光尚未脱离纳米粒子。为了使用某种类型的纳米颗粒，有必要知道其在应用后在每个器官中的分布方式和位置以及离开器官和身体前的所需时间，这称为纳米粒子的生物分布。当前的演示利用基于背散射电子显微镜（BEM）和能量分散光谱（EDS）的分析来了解磁电纳米粒子（MENs）的生物分布，实验成功的关键在于纳米粒子在体内的时间及其大小。
实验方法：
1.纳米粒子注射和器官收集
1.1 静脉内将纳米颗粒注射到麻醉的小鼠中，以实现被动靶向。
1.2 根据实验要求在注射后的所需时间点，对小鼠进行人道安乐死。
1.3 打开体腔，并手术切除目的器官。将器官放入10％磷酸盐缓冲的福尔马林溶液中，直至样品制备。
2. 组织样本制备
2.1 使用镊子将小鼠组织从固定剂转移到磷酸盐缓冲液（PBS）中。摇动3次，每次10分钟。
2.2 取出组织并搽干。然后将其放入含OCT的塑料模具中。在-80°C下储存过夜。
2.3 第二天，将样品转移到低温恒温器中，并将温度设置为-23°C。
2.4 标记带有器官类型和纳米颗粒大小的载玻片，然后将它们放在低温恒温器的架子上。
2.5 用OCT盖住低温恒温器卡盘，然后将样品放在顶部。将萃取器柱塞降低到样品上方，并使其平衡3-5分钟。
2.6 将卡盘安装到样品架上并调整方向，以使刀片可以在冷冻样品上笔直切割。
2.7 收集切片。在每张载玻片放置两张切片，并将其放置到切片架中。在室温下干燥。
2.8 干燥后，将载玻片架浸入50％乙醇中3分钟以去除OCT，从而使样品脱水。然后将样品架转移到80％的乙醇中3分钟，然后将样品架以1：1的冷甲醇与丙酮的比例在-20°C下放置10分钟。
2.9 卸下滑架，沥干多余的溶剂。 20–30分钟后，将玻片放入玻片盒中，并保存在-20°C的冰箱中直至成像。
3.使用SEM和EDS进行高分辨率成像
3.1 按照“生物样品的SEM成像”说明书中所述准备样品。然后将样品装入SEM。
3.2 打开SEM，将工作距离调整到5毫米左右，并将加速电压和电子束电流调整到25 keV。
3.3 开始成像并放大至约1,000-2,000X放大倍率，以查看包含纳米粒子的结构。
3.4 将BSD插入相同的参数，并将载物台沿z方向移动相同的工作距离。
3.5 以大约相同的放大倍率开始成像，并检查是否可以在存在纳米颗粒的情况下看到高对比度并保存图像。
3.6 通过调节不同的BSD配置来获取对纳米粒子显示最高对比度的图像。
3.7 放大显示纳米粒子或纳米粒子团的高对比度区域。
3.8 打开第二摄像头，并将EDS插入系统。
3.9 在EDS计算机（仍在工作站）上打开Aztec程序，并从SEM获取图像。
3.10 EDS将显示从该点开始的特征X射线的光谱。在图形上识别纳米颗粒材料的峰值。以此证实寻找的是纳米颗粒，而不是污染物。
3.11 返回样本并使用Atlas软件进行图像的描绘。选择“Organ”协议以创建该区域的图像，然后让其运行。
3.12 图像描绘结束后将其导出为Tif文件
3.13 在软件ImageJ中打开Tif文件，并调整对比度阈值以突出显示对比度高的区域（即纳米颗粒）。使用内置函数定义像素大小来量化纳米粒子的体积。
3.14 通过重复上述步骤可描绘显示出不同时间点或不同样品的图。
3.15 在计算每周每个器官的生物分布后，生物分布图将显示生物分布和纳米颗粒浓度的变化。这些显示了峰值浓度，还提供了纳米粒子从器官清除所需的时间信息。
结果
实验样品中的MEN是钡和钛磁电纳米粒子，它们通过注射引入小鼠器官，然后被动地靶向器官。在注射后1周，4周和8周后采集器官并保存。然后使用切片机经肝、脾、肺、肾和脑等器官进行切片，并使用“生物样品的SEM成像”方法中所述的样品制备方法进行制备。下图说明了如何从图像中提取生物分布数据。如图1所示，使用BSE检测器检测纳米颗粒的对比度。图2中EDS数据显示，钛和钡的簇对应于使用BSE检测器收集的图像中高对比度的区域。
图1：肺部的二次电子图像（左）和同一区域的反向散射电子图像（右）。
图2：EDS数据，显示图像的钛和钡簇，与使用BSE检测器看到的高对比度区域。
在合成图像中，如图3所示，红色圆圈表示高对比度并含纳米颗粒的位置。然后可以计算出白色纳米颗粒区域的体积，并根据器官本身的大小上求平均值。在图4中，该图显示了在8周的过程中30 nm尺寸的纳米颗粒总体上减少量，计算出纳米材料的清除率。
图3：使用Atlas软件创建的合成图像的各个部分。
图4：小鼠注射30 nm纳米颗粒在肺，肝，脾和肾中的生物分布。
图5中提供了有关大小不同的粒子的器官分布的数据。该图说明了纳米粒子尺寸的变化如何能够增加纳米粒子进入细胞的整体吸收率或清除率。
图5：随时间变化大小的纳米粒子的生物分布。
在磁共振成像应用中，金属纳米颗粒通常用作造影剂，以可视化组织结构和功能。它们是检测动脉粥样硬化斑块的有用诊断探针。整合诊断和治疗能力的纳米粒子被称为治疗学。纳米颗粒可同时检测早期肿瘤并输送化学治疗剂。本实验证明了如何使用SEM来计算随时间推移注入体内的纳米颗粒的生物分布。本实验可以在其他具有纳米颗粒的样品或细胞培养物中进行重复，以分析纳米颗粒的浓度，细胞渗透或清除率。这种测量的结果在许多领域都能发挥重要作用，可用于药物开发和造影剂研究。
